Заготовка и хранение пуповинной крови

Главный гематолог Санкт-Петербурга, доктор медицинских наук, профессор Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н., Сельцер А.В.
Сравнение трех вариантов получения плацентарной крови // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Материалы научно-практической конференции.- Санкт-Петербург.- 2000.

Способы заготовки пуповинной крови

Учитывая небольшие объемы крови, которые можно получить из вены пуповинного канатика (в среднем, не более 100 мл), на передний план выступает необходимость заготовки максимального количества крови и снижения риска бактериальной контаминации образцов ПК.

Нами проведено исследование разных способов сбора плацентарной крови путем дренированирования вены пуповины. Систему для сбора плацентарной крови готовили до начала родов в стерильных условиях. В контейнер "Компопласт" 300 при помощи шприца вливали антикоагулянт - "глюгицир" (раствор гидроцитрата натрия) в количестве 30 мл. Такого количества антикоагулянта достаточно для стабилизации 120 мл крови. Непосредственно перед родами соединяли "Компопласт" 300 с устройством для взятия крови "ВК 10-01". Сбор плацентарной крови дренажным методом проводили в условиях родильного зала в трех вариантах: при физиологических родах, при нахождении плаценты in utero и ex utero, а также при кесаревом сечении.

В первом варианте производили сбор крови при физиологических родах после рождения ребенка и отделения его от последа (плацента в этот момент находилась внутри матки - in utero). Пуповинный канатик на протяжении 8-12 см в месте предполагаемой пункции тщательно обрабатывали 5% настойкой йода и 70% раствором этилового спирта. После этого производили пункцию вены пуповинного канатика. При этом следует учесть, что в пуповинном канатике проходят две артерии и одна вена, которая имеет бoльший диаметр, что легко определяется визуально. Контейнер "Компопласт" 300 с антикоагулянтом располагали на 50-80 см ниже уровня положения роженицы для того, чтобы плацентарная кровь самопроизвольно оттекала по соединительным трубкам в контейнер под действием силы тяжести. Вся процедура сбора обычно длилась не более 10 мин. При наступлении обескровливания плаценты соединительную трубку от контейнера перекрывали карабином, а устройство для взятия крови "ВК 10-01" отсоединяли.

Во втором варианте сбор ПК осуществляли, когда плацента была уже выделена из матки (ex utero). Ее укладывали на стерильную рамку с отверстием для канатика пуповины плодной поверхностью книзу. Обработку канатика, пункцию вены и дренаж крови осуществляли таким же способом, как описано выше. При отсутствии рамки сбор ПК осуществляли следующим образом: помощник, нежно охватив руками плаценту плодной поверхностью книзу, приподнимал ее на 50-80 см над уровнем положения контейнера так, чтобы кровь самопроизвольно оттекала в контейнер при пункции вены пуповинного канатика.

Третий вариант сбора осуществляли при кесаревом сечении. Методика сбора крови была аналогична предыдущей. Однако следует подчеркнуть, что сбор крови в этом случае следует осуществлять незамедлительно. Это связано с тем, что во время операции при активном отделении плаценты от матки идет массивная механическая травматизация последа, что привносит выброс большого количества тканевого тромбопластина в ПК и приводит к быстрой свертываемости крови внутри сосудов плаценты.

После сбора крови контейнер с ПК взвешивали для определения массы собранной крови. Перерасчет массы крови на объем осуществляли путем деления массы на плотность ПК с раствором "глюгицир", которая составляет 104-105 г в 100 мл. В крови определяли содержание лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина, а также осуществляли бактериологический посев крови на стерильность.

Было осуществлено 86 сборов ПК дренажным способом из вены пуповинного канатика. В 45 случаях плацента находилась внутри матки (in utero) в момент сбора крови, в 9 случаях сбор осуществляли после выделения плаценты из матки (ex utero) и в 32 случаях - после кесарева сечения. Необходимо отметить, что после кесарева сечения в 4-х случаях (12,5%) нам не удалось собрать кровь в связи с тем, что плацента была массивно повреждена, поэтому произошло внутрисосудистое свертывание крови. При бактериологическом исследовании пуповинной крови различными способами на стерильность из 22-х обследованных образцов не было получено ни одного бактериального загрязнения.

Анализируя результаты трех способов сбора ПК, было установлено, что объемы собираемой крови существенно не различались (p>0,05). Сравнивая содержание лейкоцитов в образце ПК, полученном при единичном сборе (абсолютное количество) и в 1 мл крови (относительное содержание лейкоцитов), мы установили, что при кесаревом сечении было получено существенно меньше ядросодержащих клеток (ЯСК), чем при двух других способах, p<0,02 и p<0,01, соответственно (см. таблицу 1). Такая разница в абсолютном и в относительном содержании ЯСК объясняется тем, что в момент естественных родов плод испытывает родовой стресс, который способствует централизации дополнительного количества лейкоцитов.

Таблица 1
Сравнительная оценка различных способов сбора ПК
дренированием вены пуповинного канатика

№	Нахождение плаценты во время сбора крови	Количество сборов ПК	Средний объем ПК (мл)	Абсолютное количество ЯСК в образце ПК (х108)	Количество лейкоцитов в 1мл крови (х106/Л)
1	In utero	45	70,7±27,8	11,2±6,7	15,2±5,2
2	Ex utero	9	67,8±40,3	11,5±8,4	15,9±3,8
3	Кесарево сечение	28	73,7±26,4	7,7±3,5	10,6±3,2
	Достоверность различий		P1,2,3 > 0,05	P1,2 к 3 < 0,02	P1,2 к 3 < 0,01

Нами установлена обратная корреляция получаемого объема крови и абсолютного содержания лейкоцитов в образце от времени, которое проходило с момента рождения ребенка до момента перевязки пуповинного канатика независимо от способа сбора (r=-0,637; p<0,001 и r=-0,358; p<0,01, n=82, соответственно). Было отмечено, что, если с момента рождения ребенка до момента пережатия пуповины проходило менее 14 секунд, то средний объем ПК составлял 81,0±26,9 мл (от 24 мл до 141 мл), а абсолютное содержание лейкоцитов составляло от 2,7х108 до 33,8х108 (11,4±6,5х108). Если этот период был более продолжительным, то средний объем крови составлял 46,8±15,2 мл (от 16 мл до 76 мл), а абсолютное содержание лейкоцитов составляло от 2,1х108 до 14,2х108 (6,3±3,2х108), что значительно меньше (p<0,001), чем в первом случае.

Известно, что раннее отделение ребенка от последа не влечет за собой каких-либо отрицательных последствий для новорожденного (Bertolini F. и др. [3] и Lazzari L. и др. [9]). Поэтому, если нет акушерских или неонатальных показаний для выдержки более длительных сроков до момента перевязки пуповины, акушерская тактика может учитывать интересы персонала, осуществляющего сбор пуповинной крови и производить перевязку пуповины сразу после рождения младенца.

Получение ядросодержащих клеток из пуповинной крови

Целью выделения ядерных клеток из ПК является уменьшение общего объема крови для дальнейшего замораживания клеток (экономия места) и удаление эритроцитов из-за опасности развития гемолитической реакции при трансфузии клеточной взвеси, несовместимой по эритроцитарным антигенам (А, В, 0, резус и др.).

Наибольшее распространение получил метод выделения ЯСК в градиенте плотности фиколла [11]. Сепарация в градиенте плотности позволяет получить преимущественно мононуклеарные клетки, но приводит к значительным потерям гемопоэтических предшественников (от 30 до 50%) [4, 7].

Для ускоренной седиментации эритроцитов и выделения ЯСК в последние годы все шире используют раствор желатина или гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), которые позволяют получить от 80% до 90% ЯСК.

Мы изучили три способа сепарации пуповинной крови. В первом методе в качестве седиментирующего средства использовали раствор ГЭК (10% HAES, выпускаемый фирмой Frisenius, Германия) в соотношении ГЭК:ПК - 1:4. Осаждение эритроцитов происходило в течение 40-45 мин, после чего супернатант собирали пипеткой, а оставшуюся клеточную взвесь подвергали второй седиментации. Супернатант, выделенный после осаждения эритроцитов, дважды отмывали от ГЭК в среде RPMI (Sigma, США) путем центрифугирования с частотой оборотов 1500/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок собирали пипеткой и исследовали сохранность ЯСК, МНК, КОЕ-ГМ, а также подсчитывали примесь остаточных эритроцитов.

Во втором методе использовали раствор желатина. Для этого смешивали 3% раствор желатина с ПК в соотношении 1:1. Седиментация эритроцитов длилась 20-25 минут, после чего супернатант собирали пипеткой, а оставшуюся клеточную взвесь подвергали второй седиментации. Отмывание и исследование сохранности клеток происходило так же, как и в первом способе.

Для сепарации в градиенте плотности использовали фиколл (Histopaque, фирма Sigma Diagnostics®, США). Для этого в пробирку наливали фиколл, на который осторожно наслаивали ПК и подвергали центрифугированию при частоте оборотов 1500/мин в течение 25 минут. Кольцо, состоящее из ЯСК, собирали пипеткой, дважды отмывали от примеси фиколла и исследовали сохранность клеток как в первом случае. Результаты сепарации ПК приведены в таблице 2.

Таблица 2
Сравнительная характеристика различных методов выделения клеток
из пуповинной крови

№	Средство, используемое для сепарации	n	Выделение ЯСК (%)	Выделение МНК (%)	Выделение КОЕ-ГМ из 1мл ПК (х103)	Удаление эритроцитов (%)
1	ГЭК	23	84,0±9,9	86,1±10,8	1,37±0,79	98,4±0,8 2
2	Желатин	23	83,4±10,4	83,6±12,3	2,70±3,33	97,9±1,2 3
3	Histopaque	13	28,8±11,6	55,0±21,3	1,89±2,41	99,4±0,3
	Достоверность		P1 к 3 <0,001 P2 к 3 <0,001	P1 к 3 <0,01 P2 к 3<0,01	P1 к 2>0,05 P2 к 3 >0,05	P1 к 3<0,05 P2 к 3 <0,05

Как видно из таблицы 2, выделение ЯСК и МНК существенно не различалось при использовании седиментирующих растворов ГЭК и желатина. Однако при их сравнении с методом выделения в градиенте плотности фиколла как по показателю выхода ЯСК (P<0,001), так и МНК (P<0,01) выявлена существенная разница. При сопоставлении всех трех методов сепарации ПК по выделению КОЕ-ГМ достоверных различий получено не было. Однако следует отметить, что при использовании желатина среднее количество КОЕ-ГМ было больше, чем при использовании гидроксиэтилкрахмала и фиколла (в 2 и в 1,4 раза, соответственно). Примесь остаточных эритроцитов была достоверно меньше при использовании фиколла, но с практической точки зрения роли не играла. Поэтому, сепарацию с использованием раствора желатина следует считать самой эффективной.

Долгосрочное хранение клеток, выделенных из пуповинной крови

Наиболее опасными для жизнеспособности клеток при их заготовке являются этапы замораживания и размораживания. При замораживании гемопоэтических клеток значительная их часть может разрушаться. В основном это происходит в фазу кристаллизации. Для уменьшения процента гибели клеток используют специальные вещества - криопротекторы. В последние годы наибольшее распространение получил криопротектор - диметилсульфоксид (ДМСО), который обладает достаточно эффективной ограждающей способностью. Однако, помимо защитной функции, ДМСО в высоких концентрациях может оказывать токсическое действие на клетки крови, приводящее в конечном счете к их гибели. Поэтому, в последние годы отмечена тенденция в разработке оптимальных методов криоконсервирования костного мозга и клеток пуповинной крови путем сочетания в одном растворе нескольких ограждающих веществ различного механизма действия в низких концентрациях (интрацеллюлярного раствора диметилсульфоксида (ДМСО) и экстрацеллюлярного раствора гидроксиэтилкрахмала, альбумина) [1, 2, 12]. Такое сочетание позволяет снизить токсическое воздействие криопротектора на клетки, не уменьшая их жизнеспособности.

Нами изучена эффективность сочетания различных криопротективных средств, используемых в ограждающих растворах, для предохранения от холодового повреждения клеток ПК. Для этого использовали общепринятую концентрацию ДМСО (10% в конечной концентрации) в сочетании с аутологичной сывороткой (АС) и сниженные концентрации ДМСО (5%) в сочетании с гидроксиэтилкрахмалом и АС.

Клеточную взвесь получали путем седиментации эритроцитов ПК с использованием 3% раствора желатина с последующим отмыванием как было показано выше. В дальнейшем клеточную взвесь, концентрация которой составляла 60-90х106 клеток/мл, разливали в пробирки для криоконсервирования по 1,5 мл в каждую и охлаждали до +4°С. Конечная концентрация ЯСК с ограждающим раствором составляла 20-30х106/мл.

Приготовление ограждающих растворов осуществляли в боксе на ледяной бане (для поддержания температуры +4°С) с соблюдением стерильности. Для замораживания и хранения клеточной взвеси использовали пробирки объемом 5 мл, выпускаемые фирмой Sarstedt - Германия, поэтому и расчеты производили на соответствующий объем. Ниже приведены разновидности различных сочетаний криопротекторов в ограждающих растворах.

1. Криозащитный раствор состоял из 5% ДМСО, 20% аутологичной сыворотки и 45% среды RPMI (в конечной концентрации). Для приготовления такого раствора к 1,0 мл охлажденной до +4°С аутологичной сыворотки приливали по каплям с постоянным механическим помешиванием 0,25 мл ДМСО (Dimethylsulfoxid, SERVA, Feinbiochemica, Heidelburg) и 2,25 мл среды RPMI. Такой ограждающий раствор, охлажденный до +4°С, медленно при постоянном механическом помешивании приливали к 1,5 мл клеточной взвеси. После этого, клеточную взвесь с ограждающим раствором, охлажденную до +4°С, плотно закрывали крышкой и помещали в аппарат программного замораживания.
2. Криозащитный раствор состоял из 5% ДМСО, 4% ГЭК, 20% АС и 5% среды RPMI. Для такого ограждающего раствора брали 1,0 мл сыворотки, 0,25 мл ДМСО, 2,0 мл 10% раствора ГЭК. Ограждающий раствор готовили и приливали к клеточной взвеси как в первом случае.
3. Криозащитный раствор, представленный 10% ДМСО, 20% АС и 40% среды RPMI. Для приготовления ограждающего раствора брали 1,0 мл аутологичной сыворотки, 0,5 мл ДМСО и 2,0 мл среды RPMI. Ограждающий раствор готовили так же, как и в первом случае.

1 этап - снижение температуры с +4°C до -20°C со скоростью 1°C/мин;
2 этап - снижение температуры с -20°C до -40°C со скоростью 2°C/мин;
3 этап - снижение температуры с -40°C до -80°C со скоростью 4°C/мин с последующим погружением пробирок с клеточной взвесью в жидкий азот (t= -196°C).

Таблица 3
Сравнительный анализ эффективности различных ограждающих сред

Ограждающие растворы	n	Сохранность ЯСК (%)	Сохранность МНК (%)	Витальность (%)	Сохранность КОЕ-ГМ (%)
5%ДМСО	10	88,6±16,2 56,0 - 99,8	92,2±13,7 61,0-100,0	68,0±11,1 56,0-78,0	55,9±33,9 10,2-87,3
5%ДМСО+ 4% ГЭК	10	92,8±8,9 68,4-99,0	96,1±5,4 83,7-100,0	80,0±18,2 31-99	53,0±33,1 10,6-96,3
10%ДМСО	12	89,4±12,5 56,7-99,9	93,3±10,0 70,2-100,0	74,9±22,9 11-99	91,1±26,7 39,9-107,3

При анализе представленных данных было установлено, что использование стандартной концентрации ДМСО (10%) позволяет получить бoльшую сохранность КОЕ-ГМ (P<0,01), по сравнению с ограждающими растворами, в которых использовали сниженные концентрации ДМСО (5%). При этом, какой либо разницы с использованием и без использования раствора ГЭК не было выявлено. Однако применение экстрацеллюлярного криопротектора ГЭК позволило увеличить сохранность клеток (ЯСК, МНК и витальность). Учитывая, что при трансплантации наиболее важное значение имеет не столько общая сохранность ЯСК, сколько сохранность гемопоэтических клеток, ограждающие растворы, в состав которых входит ДМСО в конечной концентрации 10%, следует считать более эффективными.

В настоящее время продолжается изучение допустимых сроков хранения гемопоэтических клеток ПК 18 замороженных образцов крови, заготовленных в сентябре - декабре 1998 года.

Таким образом, проведенная нами исследовательская работа показала возможность эффективной заготовки ПК. При сравнительном анализе различных методов выделения клеток пуповиной крови было установлено, что раствор желатина, используемый для ускоренной седиментации, позволяет получить наибольшую сохранность коммитированных клеток (КОЕ-ГМ). Изучение различных ограждающих сред показало, что использование стандартной концентрации ДМСО (10%) для длительного хранения клеток следует считать более эффективным, чем сниженные концентрации данного криопротектора. Полученные данные помогут при создании банка пуповинной крови, который обеспечит поиск неродственных донорских стволовых клеток из пуповинной крови для лечения многих заболеваний системы крови у детей.

Список литературы

1. Федотенков А.Г., Шишкина И.Д. Данилова Л.Д. и др. Ограждающие растворы для криоконсервирования костного мозга// Гематол. и трансфузиол.- 1992. - №7-8.- с.12-15.
2. Чуйков В.А. Механизм криозащитной эффективности и фармакологические свойства диметилсульфоксида// Криобиология.- 1989.- №1.- с. 3-10.
3. Bertolini F., Battaglia M. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns// Blood.- 1995.- Vol.85.- p.3361-3362.
4. Denning-Kendall P, Donaldson C, Nicol A et al. Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking// Exp Hematol.- 1996.- Vol.24.- N 12.- p.1394-1401.
5. Forte K.J. Alternative donor sources in pediatric bone marrow transplantation// J. Pediatr. Oncol. Nurs.- 1997.- Vol.14.- N 4.- p.213-224.
6. Glave P.B., Beatty P., Ash R. et al. Therapy for chronic myelogenous leukemia with unrelated donor bone marrow transplantation: Results in 102 cases// Blood.- Vol.75.- p.1728.
7. Gluckman E. European Organization for cord blood banking// Blood Cells.-1994.-Vol.20.-N 2.-p.601-608.
8. Kogler G., Sarnowski A., Wernet P. Volume reduction of cord blood by Hetastarch for long-term cell banking// Bone Marrow Transplant.- 1998.- Vol. 22.- Suppl. 1.- p. S14-S15.
9. Lazzari l., Corsini C., Curioni C. et al. The Milan Cord Blood Bank and the Italian Cord Blood Network// J. Hematother.- 1996.- Vol.5.- N 2.- p.117-122.
10. Rubinstein P., Rosenfield R.E., Adamson J.W. et al. Stored Placental Blood for Unrelated Bone Marrow Reconstitution// Blood.- 1993.- Vol.81.- N 7.- p.1679-1690.
11. Rubinstein P., Taylor P.E., Scaradavou A. et al. Unrelated placental blood for bone marrow reconstitution: Organization of the placental blood program// Blood Cells.- 1994.- Vol.20.- N 2.- p.587-600.
12. Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone marrow transplantation using unfractionated cells cryopreserved in dymethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without controlled-rate freezing// Blood.- 1987.- Vol.70.- N 4.- p.974-978.
13. Wagner C.E. and Wagner J.E. Placental and/ or umbilical cord blood: an alternative source of hematopoietic stem cell for transplantation// Blood.- 1997.- Vol. 90.- N 12.- p.4665-4678.