Трёхмерное In vitro моделирование печеночной ткани с использованием внеклеточной матрицы

оздание сложных паренхиматозных органов, таких как печень, поджелудочная железа, методами тканевой инженерии, представляет собой сложную задачу. Основная сложность заключается в формирование трехмерной (3D) структуры ткани. В настоящее время в экспериментальных и клинических работах упор делается на применении пористых биополимеров с заданными свойствами. Для каждого типа ткани они различны - от коллагенновых губок до сложных полимеров на основе гидроксиапатита. Применяемые биоматериалы удовлетворят всем, предъявляемым к ним требованиям в большей или меньшей степени, однако, оптимальной биоматрицей для клеточной культуры все же является регионарная безклеточная основа (внеклеточный матрикс) [3,4,5,6]. Внеклеточный матрикс обладает набором белков и факторов роста, характерным для каждого типа тканей. Ранее для получения трехмерной культуры печеночной ткани использовались внеклеточные матрицы подслизистой основы тонкой кишки [7]. Так же предпринимаются попытки применения постоянного магнитного поля для создания 3D- организации клеточной культуры.

В журналt Tissue Engineering опубликована исследовательская работа по применению новой внеклеточной матрицы для создания 3D-органной культуры печени. В качестве матрицы для 3D модели печеночной ткани была предложена донорская внеклеточная печеночная матрица.

У 2 –3 месячных крыс было выделено 200 –300 млн. гепатоцитов, которые затем культивировались на матрице. Внеклеточная печеночная матрица (LBM) была получена путем децелюдяции в дистиллированной воде с течение 24 часов, с последующей отмывкой и стерилизацией гамма облучением. Толщина матрицы составляла 5 мм (рис. 1). Культура гепатоцитов была разделена на 3 равные части, которые были помещены на внеклеточную печеночную матрицу, между двумя слоями коллагена и на пластике, сорбированном коллагеном 1-го типа. После суточного культивирования взвешенные в суспензии клетки были удаленны. Среда менялась ежедневно и сохранялась для биохимического анализа. Культивирование продолжалось в течение 35 дней.

По истечении этого срока произведен анализ сред в которых культивировались гепатоциты. Изучались белковые фракции и мочевина. Клетки, которые находились на внеклеточной печеночной матрице продемонстрировали активный метаболизм анаболического характера с нарастанием синтеза белковых молекул и оптимизацией синтеза мочевины. Клетки которые находились в коллагеновом бислое так же показали активный метаболизм и синтез белка, а культивированные на пластике гепатоциты в скором времени прекратили синтез белка и мочевины. Однако, по данным электронной микроскопии и прижизненной иммунофлюоресценции было отмечено снижение пролиферативной активности гепатоцитов на LBM, чуть большее количество клеток было на коллагеновом бислое (по сравнению с LBM) и значительное увеличение на пластике (рис. 2).

Таким образом, было показано, что донорская внеклеточная печеночная матрица обладает свойствами регионарной внеклеточной матрицы и поддерживает достаточный синтетический, пролиферативный и биохимический потенциал гепатоцитов, вероятно вследствие наличия тканеспецифических сигнальных белковых молекул и факторов роста и дифферинцировки.

По материалам

Литература:

1. Allen JW, and Bhatia SN. Engineering liver therapies for the future. Tissue Eng 2002; 8: 725
2. Akira Ito, et al. Tissue engineering using magnetite nanoparticles and magnetic force: heterotypic layers of cocultured hepatocytes and endothelial cells. Tissue Eng 2004; 10; 5/6: 833-341
3. Dunn, J.C., et al. Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: Long-term culture in a sandwich configuration. FASEB J 1989; 3; 2: 174-177
4. Lindberg K, and Badylak SF. Porcine small intestinal submucosa (SIS): A bioscaffold supporting in vitro primary human epidermal cell differentiation and synthesis of basement membrane proteins. Burns 2001; 27: 254
5. Badylak S, et al. Resorbable bioscaffold for esophageal repair in a dog model. J Pediatr Surg 2000; 35: 1097
6. Schmidt C, Baier JM. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials 2000; 21: 2215-2231
7. Ogawa K, et al. The generation of functionally differentiated, three-dimensional hepatic tissue from two-dimensional sheets of progenitor small hepatocytes and nonparenchymal cells. Transplantation 2004; 77; 12: 1783–1789