Пуповинная кровь – источник стволовых клеток

Сбор пуповинной крови.
Обследование беременной.

До начала сбора пуповинной крови беременная женщина должна дать информированное согласие на сбор и хранение пуповинной крови ее новорожденного ребенка. Тщательно изучается соматический, акушерско-гинекологический и семейный анамнез у беременной для выявления возможных генетических нарушений и инфекционных заболеваний, передающихся гематогенным путем [21]. Каждую беременную обязательно обследуют на носительство HBS-Ag, наличие антител к возбудителям гепатита С, ВИЧ-инфекции, сифилиса, Т-клеточного лейкоза человека и цитомегаловирусной инфекции. При выявлении положительных серологических реакций у беременной забор пуповинной крови противопоказан.

R. Scott (2001) подчеркивает, что для выявления инфекционных заболеваний следует производить обследование крови беременной женщины, а не саму пуповинную кровь. Поскольку, во-первых, применяемые современные тесты основаны на выявлении антител к возбудителям, а антитела матери не проникают через плаценту и исследование пуповинной крови может дать ложно отрицательный результат, а во-вторых, использование пуповинной крови для тестирования уменьшает объем пуповинной крови, пригодный для трансплантации [21].

Методы забора пуповинной крови.

Сбор пуповинной крови осуществляется после рождения ребенка и отделения его от последа, когда плацента еще находится в полости матки, или после рождения последа, а также во время операции кесарева сечения. Для сбора пуповинной крови используют специальную трансфузионную систему, содержащую антикоагулянт, и оснащенную дренажной иглой. Выделяют закрытый и открытый способы заготовки пуповинной крови [3,7]. При первом способе после рождения ребенка и пересечения пуповины, когда плацента находится еще в полости матки, производят иглой дренирование пупочной вены, кровь самотеком оттекает в трансфузионную систему. Предварительно пупочный канатик обрабатывают раствором йода или этилового спирта. В пупочном канатике проходят два сосуда: одна вена и две артерии. Отличительными особенностями вены пуповины является больший диаметр и меньшая извитость по сравнению с артериями. При открытом способе забора пуповинной крови после рождения ребенка и отделения и рождения последа плаценту укладывают на специальную рамку с отверстием для пуповины плодовой поверхностью вниз. После обработки пупочного канатика также дренируют пупочную вену и собирают кровь в систему с антикоагулянтом.

При операции кесарева сечения после удаления последа пуповинную кровь собирают аналогично открытому способу.

При закрытом способе сбора средний объем получаемой крови составляет 70-80 мл [3], при открытом несколько меньше – 60-70 мл, при этом при закрытом способе вероятность микробной контаминации ниже [21]. Ряд авторов (Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н., 2000) предлагают использовать активную инфузию крови из вены пуповины шприцами, что по их данным позволяет увеличить объем получаемой крови до 90-95 мл.

Большое значение при сборе пуповинной крови имеет время наложения зажимов на пуповину после рождения ребенка. F. Bertolini et al (1995) показали, что если пуповина клеммируется в течение 30 секунд после рождения ребенка, то объем собираемой крови в среднем составляет 77±23мл, а если позже 30 секунд, то объем получаемой пуповинной крови уменьшается как минимум вдвое [4]. По мнению большинства исследователей редко удается получить образцы пуповинной крови более 100 мл.

Тестирование пуповинной крови.

Каждый образец пуповинной крови тестируется на количество ядросодержащих клеток, CD34+, КОЕ-ГМ. Проводится также HLA-типирование, определение группы крови по ABO и резус-фактору. Кроме того, осуществляют бактериологический посев, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на ЦМВ и ВИЧ-инфекцию.

Некоторые авторы [3,7] рекомендуют исследовать пуповинную кровь на выявление ряда генетических заболеваний: α-талассемия, серповидноклеточная анемия, дефицит аденозиндезаминазы, агаммаглобулинемия Брутона, болезни Харлера и Гюнтера.

Краткосрочное хранение пуповинной крови.

Длительное хранение пуповинной крови осуществляется в специальных банках пуповинной крови, которые сконцентрированы в крупных гематологических центрах. В связи с этим актуален вопрос о хранении пуповинной крови до момента ее криоконсервирования. С. В. Юрасов и др. (2000) показали, что при хранении пуповинной крови при комнатной температуре (22°С) или при 4°С в течение 24-48 часов жизнеспособность клеток пуповинной крови принципиальной не снижалась и составляла соотвественно 92% и 88%. Однако, при хранении образцов крови в течение 3 суток отмечалось значительное снижение жизнеспособности ядросодержащих клеток. Как отмечает R. Scott (2001) не следует хранить пуповинную кровь без специальных криоконсервантов более 36 часов [21].

Перед долгосрочным хранением пуповинной крови проводят ее сепарацию для выделения ядросодержащих клеток. Сепарация пуповинной крови приводит к удалению эритроцитов и гранулоцитов. Эти клетки при замораживании и размораживании лизируются и продукты лизиса могут вызывать неблагоприятные реакции у реципиента. Кроме того, удаление эритроцитов снижает риск развития реакции несовместимости по эритроцитарным антигенам (АВО и Rh). В целом уменьшается и объем крови, оставленный на хранение.

Долгосрочное хранение пуповинной крови.

Наиболее опасными для жизнеспособности клеток при их заготовке являются этапы замораживания и размораживания. При замораживании гемопоэтических клеток значительная часть их может разрушаться. В основном это происходит во время перехода межклеточной среды из жидкой в твердую фазу. Для уменьшения процента гибели клеток используют специальные вещества – криопротекторы. Хранение пуповинной крови осуществляется в жидком азоте.

Недавние работы E. Broxmeyer et all (2002) показали, что после 15 лет хранения в замороженном состоянии стволовые клетки пуповинной крови сохраняют свою пролиферативную активность и поэтому остаются пригодными для трансплантации [5].

Заготовленная пуповинная кровь хранится в специализированных национальных и частных банках пуповинной крови, созданных в США и в европейских странах. Родители могут сохранять пуповинную кровь новорожденного только для родственных трансплантаций, т.е. для ее использования у этого ребенка (аутологичная трансплантация) или его братьев и сестер (аллогенная родственная трансплантация) в случае развития у них заболеваний, требующих трансплантации стволовых клеток. В таком случае они платят за сбор, тестирование, замораживание и хранение образца пуповинной крови [5,6,8]. Однако, большинство образцов пуповинной крови (90%) хранятся для использования при неродственной аллогенной трансплантации. В этом случае родители дают информированное согласие на использование пуповинной крови как для неродственной аллогенной трансплантации, так и для научных исследований. В последнем случае забор, тестирование и хранение образца пуповинной крови осуществляется бесплатно.

Размораживание стволовых клеток пуповинной крови осуществляется непосредственно перед инфузией при температуре 37 °С. Размороженные клетки вводят на инфузионной среде, например декстране или альбумине [3,21].

Показания к применению стволовых клеток.

В настоящее время трансплантацию стволовых клеток пуповинной крови применяют при различных заболеваниях системы кроветворения, иммунной системы и нарушениях обмена (табл. 1).

Исследование, проведенное V. Rocha (2001), показало, что отдаленная выживаемость детей, больных острым лейкозом, после трансплантации стволовых клеток пуповинной крови от HLA-идентичного донора – сиблинга сходна или даже превышает таковую после трансплантации HLA-идентичного костного мозга сиблинга [20].

Успешный исход трансплантации гемопоэтических клеток пуповинной крови зависит от количества ядросодержащих клеток, приходящихся на 1 кг массы тела реципиента и от степени совместимости по HLA-системе.

Количество ядросодержащих гемопоэтических стволовых клеток на 1 кг массы тела определяет скорость восстановления нейтрофилов и тромбоцитов у реципиента, что имеет принципиальное значение для восстановления защитной и гемостатической функций больного после химиотерапевтической миелоаблации. По данным Р. Rubinstein (1998) благоприятные исходы при аллогенной неродственной инфузии стволовых клеток пуповинной крови отмечались у пациентов, получивших не менее 3,7×107 ядросодержащих клеток из расчета на 1 кг массы тела [19]. При этом средний срок восстановления нейтрофилов составил 28 дней (у 81% больных количество нейтрофилов восстановилось к 42 дню после трансплантации), а среднее время восстановления тромбоцитов достигало 90 дней (у 85% больных количество тромбоцитов нормализовалось после 180 дней от произведенной трансплантации).

Количество получаемой пуповинной крови от одного донора ограничено: в получаемом образце содержится в среднем 10×108±5×108 ядросодержащих клеток. Поэтому, по данным Дюссельдорфского банка пуповинной крови [8] из 2100 образцов пуповинной крови для взрослых пациентов с массой тела 50-70 кг потенциальными трансплантатами могут считаться лишь 25%, для реципиентов с массой тела 35 кг – 67%, а для больных с массой тела 10 кг – 100%. В связи с этим образцы крови менее 60 мл рекомендуют сохранять в качестве возможных аутологичных трансплантатов или для пациентов в возрасте до 1 года [8]. Вторым фактором, определяющим благоприятный исход трансплантации, является степень совместимости по системе HLA. По данным Eurocord group (2000) [10] среди взрослых реципиентов, которым производилась трансплантация стволовых клеток пуповинной крови полностью совместимых по HLA-системе, смертность составила 29%, при несовместимости по одному аллелю – 34%, при несовместимости по двум аллелям – 45%, по 3 или более аллелям достигала 50%. Следует отметить. что вероятность успешной трансплантации пуповинной крови при несовместимости по 1-3 аллелям HLA-системы выше, чем при аналогичной трансплантации несовместимого костного мозга.

Реакция “трансплантат против хозяина” (РТПХ).

Выживаемость больных после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток зависит также от развития и степени тяжести реакций “трансплантат против хозяина” (РТПХ). Эти реакции вызваны агрессией иммунокомпетентных Т-лимфоцитов (CD3+) донора против клеток реципиента. Чем больше несовместимость по HLA-системе донора и реципиента, тем чаще развиваются и тяжелее протекают реакции “трансплантат против хозяина”.

Преимуществом трансплантации стволовых клеток пуповинной крови является меньшая частота развития и преобладание легких форм РТПХ [8,10,11,12,13,20,21]. Объясняется это иммунной незрелостью Т-лимфоцитов пуповинной крови и их меньшей концентрацией [10,12,21]. Объединенное европейское исследование показало, что пациенты, которым производится трансплантация родственной HLA-совместимой и неродственной HLA-совместимой пуповинной крови, подвержены меньшему риску развития РТПХ, чем при аналогичной трансплантации костного мозга [8].

Kernan с соавт. (1993) выявили, что при трансплантации костного мозга, совместимого по 6 из 6 аллелям HLA-системы, РТПХ II-IV степени тяжести развивается не менее, чем у 64% больных. В самом крупном современном исследовании трансплантации стволовых клеток пуповинной крови [19] показано, что при аналогичной трансплантации пуповинной крови РТПХ развивается лишь в 27%, при этом преобладают легкие формы.

Осложнения при трансплантации стволовых клеток пуповинной крови.
I. Ближайшие осложнения:

• Инфузионные реакции – реакция больного на криопротектор, продукты распада эритроцитов, не полностью удаленных при сепарации, а также возможные реакции при переливании любых препаратов крови. Проявляются они повышением температуры, ознобом, тошнотой, рвотой, тахикардией, затрудненным дыханием и головной болью. Частота этих осложнений существенно снижается при проведении премедикации, включающей антипиретические, антигистаминные и противорвотные препараты.
• Острая реакция “трансплантат против хозяина”

II. Отдаленные осложнения.

• Неприживаемость трансплантата. Успешный исход трансплантации зависит от многих факторов, главные из которых - количество ядросодержащих клеток на единицу массы тела больного и совместимость по HLA-системе.
• Хронические реакции “трансплантат против хозяина”
• Рецидив заболевания. В крупнейшем на данный момент исследовании трансплантации пуповинной крови [19] показано, что рецидив лейкемии после трансплантации гемопоэтических клеток пуповинной крови через 100 дней после трансплантации наблюдался у 9% больных, а через 1 год – у 26% больных.

Преимущества трансплантации пуповинной крови.

Использование пуповинной крови для трансплантации стволовых клеток имеет ряд преимуществ по сравнению с другими источниками гемопоэтических клеток:

1. Сбор пуповинной крови - безопасная, технически легко выполнимая процедура, не представляющая угрозы для здоровья матери или новорожденного (донора) и не требующая общей анестезии при сборе.
2. Замороженные образцы пуповинной крови, находящиеся в банках крови, уже тестированные и типированные по HLA-системе могут быть сразу использованы для трансплантации. Таким образом, исключаются задержки, возникающие при поиске, сборе и типировании костного мозга донора, которые могут быть фатальными для больных злокачественными заболеваниями крови.
3. Увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов для этнических меньшинств.
4. Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем, поскольку вероятность их носительства значительно ниже, чем у взрослых.
5. Выявлена большая возможность по сравнению с костным мозгом использования не полностью совместимых по HLA-системе транчсплантатов.
6. Частота развития и тяжесть течения “реакции трансплантат против хозяина” при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток ниже, чем при трансплантации костного мозга.
7. Появляется недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток пуповинной крови в качестве аутологичного трансплантата.

Таблица 1.
Заболевания, при которых производится трансплантация стволовых клеток пуповинной крови.

Острые лейкозы Острый лимфобластный лейкоз Острый миелобластный лейкоз Острый недифференцированный лейкоз	Хронические лейкозы Хронический миелоидный лейкоз Хронический лимфоцитарный лейкоз Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз
Миелодиспластические синдромы Рефрактерная анемия Рефрактерная анемия с избытком бластов	Болезни, связанные с патологией стволовых клеток Тяжелая форма апластической анемии Анемия Фанкони Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (Болезнь Маркиафавы-Микеле) Парциальная красноклеточная аплазия
Болезни, связанные с патологией пролиферации миелоидного ростка Острый миелофиброз Идиопатический миелофиброз Истинная полицитемия Эссенциальная тромбоцитемия	Лимфопролиферативные расстройства Неходжкинская лимфома Лимфома Ходжкина (лимфогрануломатоз)
Фагоцитарные дисфункции Болезнь Чедиака-Хигаши Ретикулярная дисгенезия	Гистиоцитарные дисфункции Семейный эритрофагоцитарный лимфогистиоцитоз Гистиоцитоз Х Гемофагоцитоз
Наследственные нарушения метаболизма Мукополисахаридоз Болезнь Гарлера Болезнь Гюнтера Болезнь Моркуи Адренолейкодистрофия Болезнь Краббе Метахромная лейкодистрофия	Наследственные аномалии эритроцитов Тяжелая бета-талассемия Серповидноклеточная анемия
Наследственные расстройства иммунной системы Атаксия-телеангиоэктазия Болезнь Костманна Дефицит адгезии лимфоцитов Болезнь Диджорджа	Другие наследственные растройства Болезнь Леша-Нихана Тромбастения Гланцмана Амегакариоцитоз Множественная миелома Макроглобулинемия Вальденстрема

Литература

1. Алексеев И.В., Волынец М.Д., Владимирская Е.Б. и др.// Гематол. и трансфузиол.- 1996.- Т.41.- №2.- С.16-18.
2. Владимирская Е.Б., Замараева Н.В., Волынец М.В. и др.// Педиатрия.- 1997.- №4.- С.9-12.
3. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови// Вопросы онкологии.- 2000.- Т. 46.- №5.- С.513-520.
4. Bertolini F., Battaglia M. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns// Blood.- 1995.- Vol.85.- p.3361-3362
5. Broxmeyer H.E., Srour E.F., High-efficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years // PNAS – 2002 – v.100 (2) – 645-650.
6. Denning-Kendall, P., Donaldson, C., Nicol, A., et al. Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking.// Exp Hematol. – 1996 - 24(12), 1394-1401.
7. Falkenburg J.H.F., Lim F.T.H. Использование пуповинной крови вместо костного мозга для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // РМЖ - 1996 - Т. 3 - № 4. – с. 24-31.
8. Gluckman E., Broxmeyer H.E. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilical-cord blood // N. Engl. J. Med -2001 – V.344 (24) - 1860-61.
9. Gluckman E., Broxmeyer H.E. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconis anemia by means of umbilical-cord blood from HLA-identical sibling.// N. Engl. J. Med – 1989 – 321 –1174-78.
10. Gluckman, E., Rocha, Y., Boyer-Chammard, A., et al Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group.// N Engl J Med. - 1997. - 337(6), 373-381.
11. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantattion. // Exp. Hematol. – 2000 – 28 – 1197-205.
12. Harris, D. T. Experience in autologous and allogeneic cord. blood banking. J Hematother – 1996 - 5(2), - 123-128.
13. Kernan, N. A., Bartsch, G., Ash, R. C., et al. Analysis of 462 transplantations from unrelated donors facilitated by the National Marrow Donor Program. // N Engl J Med 1993 – 1328(9), 593-602.
14. Kogler, G., Callejas, J., Hakenberg, P., et al. Hematopoietic transplant potential of unrelated cord blood: Critical issues. J Hematother – 1996 - 5(2), 105-116.
15. Kurtzberg, J., Laughlin, M., Graham, M. L., et al. Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients // N Engl J Med –1996 - 335(3), 157-166.
16. Laughlin M. J., Barcer J. Et al. Hematopoietic engraftmrnt and survival in adult recipients of umbilical-cord blood from unrelated donors. // N Engl J Med – 2001 – 344 (24) – 1815-22.
17. Rubinstein, P., Rosenfield, R. E., Adamson, J. W., and Stevens, C. E. Stored placental blood for unrelated bone marrow recon- stitution. // Blood -1993 - 81(7), 1679-1690.
18. Rubinstein, P., Dobrila, L., Rosenfield, R. E., et al. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unre- lated bone marrow reconstitution. Froc Nat Acad USA - 1995 - 92(22), - 10119-10122.
19. Rubinstein, P., Carrier, C., Scaradavou, A., et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med – 1998 - 339(22), 1565-1577..
20. Rocha V., Cornish J., Sievers E. L. Et al. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia. // Blood – 2001 –– 97 – 2962-71.
21. Scott R., Burger Umbilical Cord Blood Stem Cells- Handbook of Transfusion Medicine Academic Press - 2001 – 171-178.