|
Сбор и фракционирование пуповинной крови
А. Н. Стрижаков, Д. М. Мхеидзе, Е. В. Тимохина, В.В. Гришина
Внастоящее время значительно возрос интерес к пуповинной крови (ПК), как к альтернативному источнику репопулирующих гемопоэтических клеток пригодному для трансплантации[1,2].
Впервые трансплантация стволовых клеток, полученных из пуповинной крови сестры (сиблинга), была произведена в 1988 году шестилетнему ребенку, страдающему анемией Фанкони [3]. К настоящему времени по всему миру произведено более 2000 неродственных и более 400 родственных трансплантаций стволовых клеток пуповинной крови, как детям, так и взрослым [4-7].
Использование пуповинной крови для трансплантации имеет ряд преимуществ по сравнению с другими источниками гемопоэтических стволовых клеток[1,8]:
1. Сбор пуповинной крови - безопасная, технически легко выполнимая процедура, не представляющая угрозы для здоровья матери или новорожденного и не требующая общей анестезии при сборе.
2. Образцы пуповинной крови, находящиеся на длительном хранении в в криобанках, типированы по HLA-системе и могут быть сразу использованы для трансплантации. Таким образом, исключаются задержки, возникающие при поиске, сборе и типировании костного мозга донора, которые могут быть фатальными для больных злокачественными заболеваниями крови.
3. Увеличивается вероятность подбора гемопоэтической ткани редких HLA-типов для трансплантации представителям этнических меньшинств.
4. Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем за счет тщательного обследования образцов ПК и доноров.
5. Многими авторами отмечена эффективность использования частично совместимых по HLA-системе трансплантатов.
6. Частота развития и тяжесть течения “реакции трансплантат против хозяина” при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови ниже, чем при трансплантации костного мозга.
7. Появляется недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток пуповинной крови в качестве аутологичного трансплантата.
Принципиальным недостатком пуповинной крови можно считать малое количество гемопоэтических клеток, получаемых при единичной заготовке, а также невозможность повторного сбора [2,9,10].
Поэтому основными задачами при заготовке пуповинной крови являются:
1. максимальный забор пуповинной крови;
2. максимальное выделение ядросодержащих клеток из ПК.
Сбор пуповинной крови
До начала сбора пуповинной крови беременная женщина должна дать согласие на сбор и хранение пуповинной крови ее новорожденного ребенка. Тщательно изучается соматический, акушерско-гинекологический и семейный анамнез у беременной для выявления возможных генетических нарушений и инфекционных заболеваний, передающихся гематогенным путем [2]. Каждую беременную обязательно обследуют на носительство HBS-Ag, наличие антител к возбудителям гепатита С, ВИЧ-инфекции, сифилиса, Т-клеточного лейкоза человека и цитомегаловирусной инфекции. При выявлении положительных серологических реакций у беременной забор пуповинной крови не проводится.
Сбор пуповинной крови осуществляется после рождения ребенка и отделения его от последа, когда плацента еще находится в полости матки, или после рождения последа, а также во время операции кесарева сечения. Существуют закрытый и открытый способы заготовки пуповинной крови [2,11]. При открытом способе забора пуповинной крови возможна микробная контаминация вагинальной флорой. Риск такой возможности составляет 20-30 %[1]. В настоящее время для сбора пуповинной крови используют специальные закрытые трансфузионные системы, содержащие антикоагулянт (гепарин, кислотный-цитрат-декстроза (ACD), цитрат-фосфат-декстроза(CPD), или цитрат-фосфат-декстрозы - аденина (CPDA) [2]), и оснащенные дренажной иглой [1].
Большое значение при сборе пуповинной крови имеет время наложения зажимов на пуповину после рождения ребенка. F. Bertolini et. аl. (1995) показали, что если пуповина клеммируется в течение 30 секунд после рождения ребенка, то объем собираемой крови в среднем составляет 77±23мл, а если позже 30 секунд, то объем получаемой пуповинной крови уменьшается практически вдвое [12].
Учитывая малые количества ПК в единичном образце, некоторые авторы считают достаточным для трансплантации объемы собираемой крови не менее 40мл[16]. Поэтому образцы крови с меньшим объемом не имеет смысла криоконсервировать. Дюссельдорфский банк Неткорд с 1997года собирает только единицы крови, имеющие объем не менее 80мл., так как они пригодны для трансплантации пациентам весом 50-70 кг [17]. По опыту большинства исследователей редко удается получить образцы пуповинной крови более 100 мл. Максимальный же объем пуповинной крови по данным литературы может составить до 200 мл[8]. Фактически одной из основных задач при заборе пуповинной крови является максимально возможный её объем.
Материалы и методы
Нами проведено исследование закрытого способа получения пуповинной крови. Всего было выполнено 48 сборов.
Сбор ПК производился акушерами после рождения ребенка и пересечения пуповины в стандартный строенный контейнер для забора донорской крови(500/300/300) с антикоагулянтом путем дренирования пупочной вены. Для сбора ПК использовали 2 вида закрытых систем:
1 фирмы «Baxter» c антикоагулянтом CPDA 63 мл и пункционной иглой;
2 отечественные контейнеры типа «Гемакон» c антикоагулянтом глюгицир 100 мл и пункционной иглой;
Сбор ПК проводился в родильном зале при физиологических родах. После рождения ребенка пуповину клеммировали двумя зажимами на расстоянии 7-10 см от пупочного кольца и пересекали. До отделения плаценты после двукратной обработки раствором этилового спирта пунктировали вену пуповины в пупочном канатике. Пупочную вену пунктировали иглой, входящей в состав стандартной системы для забора донорской крови. Иглу вводили в дистальный конец пупочного канатика. Сама система располагалась на 70 см ниже уровня роженицы. Кровь самопроизвольно стекала в больший мешок(500), содержащий антикоагулянт. Заканчивали сбор пуповинной крови после полного спадения пупочной вены. После этого трубку, соединяющую иглу с мешком герметизировали с помощью металлической клеммы. Полученный материал доставляли для дальнейшей обработки в банк криоконсервированных биоматериалов РОНЦ им Н.Н. Блохина.
Для определения массы полученной ПК, биоматериал взвешивали. Проводили пересчет массы на объем крови. Пробы для тестирования брали из мешка, содержащего ПК и антикоагулянт. Количество лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, гемоглобин, гематокрит определяли на гематологическом анализаторе Culter Act8. Подсчет лейкоцитарной формулы производили в световом микроскопе при стандартной окраске мазков по Романовскому. Количество клеток с имунофенотипом CD34+ определяли в проточном цитометре FAC Scan.
Результаты
Из 48 образцов, полученной пуповинной крови , 8 собрано в систему для забора крови типа «Гемакон» c антикоагулянтом глюгицир(100 мл) и, 40 в систему для забора крови фирмы «Baxter» c антикоагулянтом CPDA(63) мл.
Средний объем полученной пуповинной крови составил(n=48) 63,5±22,7мл. (от 18 до 126 мл).
В нашем исследовании количество образцов ПК, имеющих объем < 40 мл. составило 15% от общего количества(n=48). Процент образцов ПК, имеющих объем > 80 мл., составил 23%. Остальные образцы(62%) имели объемы от 40 до 80 мл.
Мы попытались проанализировать зависимость объема, собранной пуповинной крови от массы плода. Количество наблюдений составило 28(анализировались только образцы ПК, собранные в систему «Baxter»). Данные этого анализа представлены на гистограмме1.
Гистограмма 1.
Из данной гистограммы видно, что нет прямой зависимости объема собранной ПК от массы плода. Из этого следует, что судить о предполагаемом сборе ПК только по данному критерию невозможно: либо объем ПК не зависит от массы плода, либо он действует только в совокупности с другими факторами. По данным литературы объем получаемой пуповинной крови может зависеть от многих факторов, таких как масса тела новорожденного, время пересечения пуповины, срок беременности, длина пуповины[8].
Стволовые клетки относятся к ядросодержащим клеткам(ЯСК), поэтому важной характеристикой пуповинной крови является количество ядросодержащих клеток, которое в настоящий момент является стандартной оценкой трансплантата из пуповинной крови [2,4,7,10]. Среднее количество ядросодержащих клеток в полученных нами образцах ПК (n=43) составило 0,993±0,571x109 (разброс от 0,146 x109 до 2,655 x109). Прямой зависимости между количеством лейкоцитов и объемом ПК не наблюдалось
(см. гистограмму 2).
По данным литературы необходимое количество для трансплантации ядросодержащих клеток в эксфузате пуповинной крови должно составлять не менее 2х107на килограмм веса реципиента[7]. Мы проанализировали абсолютное количество лейкоцитов в каждой единице собранной ПК с учетом этого параметра. Данные приводятся в таблице1: наибольшее количество образцов(43%) содержит 0,51-1,0x109 ядросодержащих клеток, что достаточно для трансплантации реципиенту весом 25,5-50 кг. Эксфузаты, содержащие 0,1-0,5 x109 лейкоцитов, так же возможно использовать для трансплантации у детей массой тела до 25кг. Таким образом, при принятии решения о целесообразности хранения малых объемов пуповинной крови, следует ориентироваться на количество ядросодержащих клеток в образце.
Таблица 1. Количественное распределение ядросодержащих клеток в ПК с учетом возможного использования для трансплантаций реципиентам различной весовой категории.
Количество лейкоцитов в эксфузате | 0,1-0,5 x109 |
0,51-1,0 x109 | 1,01-1,5 x109 | 1,51-2,0 x109 | >2 x109 |
% образцов в исследовании(n=43) | 19% (8) | 43% (18) | 26% (11) | 7%
(3) | 5%
(2) |
Вес реципиента из расчета 2,0 x107клеток/кг | 5-25
кг | 25,5-50 кг | 50,5-75 кг | 75,5-100
кг | >100
кг |
Для изучения гемопоэтического потенциала ПК в 22 эксфузатах произведен подсчет клеток с имунофенотипом CD34+. Среднее количество таких клеток составило 1,967±1,595x106 (разброс от 0,087х106 до 12,363х106). Это свидетельствует о том, что ПК является источником стволовых гемопоетических клеток. На сегодняшний день стандартной оценкой пуповинной крови, как материала, пригодного для трансплантаций принято считать лишь количество ядросодержащих клеток [18].
Нами так же проанализирован клеточный состав пуповинной крови. В 40 образцах произведен подсчет форменных элементов на гематологическом анализаторе. Из них в 15 определена лейкоцитарная формула. Данные приводятся в таблице 2. Наибольший разброс имеют показатели лейкоцитов, от 5,74x109/л до 27,38x109/л(15,22±5,2x109/л), и тромбоцитов, от 125x109/л до 442,31x109/л(323,35±68,36x109/л).
Таблица 2. Клеточный состав пуповинной крови
Параметры | n | Показатели ПК в ед. объема |
Лейкоциты х109/л | 40 | 15,22±5,2 (от5,74 до 27,38) |
Эритроциты х1012/л | 40 | 4,43±0,56 (от 3,43 до 5,9) |
Тромбоциты х109/л | 40 | 323,35±68,36 (от 125 до 442,31) |
Гемоглобин г/л | 40 | 156±20,5 (от 120 до 201) |
Гематокрит % | 40 | 51,48±6,85 (от 40,5 до 66,07) |
Лимфоциты % | 15 | 32,73±19,6 (от 7 до 77) |
Моноциты% | 15 | 2,6±2,41 (от 0 до 9) |
Эузинофилы % | 15 | 1,47±1,36 (от 0 до 6) |
Нейтрофилы п/я % | 15 | 22,27±10,17 (от 11 до 51) |
Нейтрофилы с/я % | 15 | 39,87±15,65(от 7 до70)
|
Выделение клеточной фракции
Пуповинную кровь можно криоконсервировать и без предварительной обработки, однако, эритроциты и гранулоциты при замораживании и размораживании лизируются и продукты лизиса могут вызывать неблагоприятные реакции у реципиента. Кроме этого эритроциты могут быть несовместимы по эритроцитарным антигенам (АВО и Rh) с реципиентом. Поэтому, а также для уменьшения объема биоматериала (экономия места), перед долгосрочным хранением пуповинной крови проводят ее фракционирование для выделения ядросодержащих клеток[2].
С целью уменьшения общего объема крови и удаления эритроцитов и гранулоцитов для дальнейшего замораживания клеток используют различные методы и вещества для выделения ядросодержащих клеток, такие как:
1. сидементация желатином или гидроксиэтилкрахмалом (гранулоциты при данном методе не удаляются) [13,14].
2. выделение ЯСК в градиенте плотности на основе фиколла или перколла[13].
3. фракционирование пуповинной крови при помощи центрифугирования (эффективен для наиболее свежих образцов) [12].
4. лизис эритроцитов хлоридом аммония[15].
Материалы и методы
Мы предлагаем для фракционирования пуповинной крови использовать полиглюкин. Всего проведено 45 опытов.
Для осаждения эритроцитов производили смешивание полиглюкина с ПК в соотношении 1:1(36 опытов) и в соотношении 1:2 (9 опытов). Полиглюкин добавляли непосредственно в больший мешок(500), содержащий ПК и антикоагулянт. После тщательного перемешивания полиглюкина с ПК, мешок подвешивали. Седиментация эритроцитов длилась 30-120минут (до появления четкой границы), после чего супернатант при помощи плазмоэкстрактора переводили в один из меньших контейнеров (второй пережимали). После этого мешок с осадком запаивали и отсекали.
Для определения массы полученный надосадок взвешивали. Проводили пересчет массы на объем. Пробы для оценки полученного материала брали из мешка, содержащий надосадок. Количество лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, гемоглобин, гематокрит определяли на гематологическом анализаторе Culter Act8.
Результаты
При добавлении полиглюкина к пуповинной крови в соотношении 1:2 среднее время осаждения эритроцитов составило 54±15мин. (от 40мин. до 70 мин.), в соотношении 1:1- 60±18 мин. (от 30 мин до 120 мин).
Для оценки данного метода фракционирования определялся % выделенных лейкоцитов, % осажденных эритроцитов, уровень гематокрита и гемоглобина в надосадке. Данные приводятся в таблице 3.
№ | Соотношение полиглюкина
К ПК | n | Выделение ЯСК(%) | Удаление эритроцитов
(%) | Гемоглобин
г/л в надосадке | Гематокрит
% в надосадке |
1 | 1:1 | 35 | 84,53±8,51 | 97,27±2,43 | 1,7±1,2 | 0,57±0,25 |
2 | 1:2 | 9 | 60,85±13,64 | 97,98±1,2 | 3,3±2,8 | 1,14±0,61
|
Из данной таблицы видно, что полиглюкин является эффективным сидементирующим веществом, который имеет ряд преимуществ перед другими веществами, переменяющимися для выделения ядросодержащих клеток из пуповинной крови, а именно:
1. Полиглюкин является легко доступным стандартным препаратом в любом медицинском учреждении.
2. Использование полюглюкина не требует отмывания клеточной взвеси после его применения.
3. Полиглюкин, благодаря своим дезагрегирующим свойствам, является наиболее благоприятной средой для ядросодержащих клеток.
Оптимальным соотношением полиглюкина с ПК при фракционировании является соотношение 1:1.
Оставшийся после фракционирования пуповинной крови осадок, содержащий в основном эритроциты, гранулоциты и плазму, мы предлагаем использовать в качестве образцов для различных анализов, необходимых для тестирования ПК.
Заключение
Проведенная нами исследовательская работа показала, что пуповинная кровь является одним из источников стволовых гемопоэтических клеток, пригодных для трансплантаций. Для сбора ПК можно использовать стандартные строенные контейнеры для забора донорской крови(500/300/300) с антикоагулянтом фирмы «Baxter» или типа «Гемакон» отечественного производства (контейнеры «Baxter» более удобны и надежны в применении, контейнеры «Гемакон» экономически более выгодны). При решении вопроса о возможности криоконсервирования ПК следует ориентироваться не на объем, а на абсолютное количество ядросодержащих клеток в эксфузате. Для эффективного выделения ядросодержащих клеток и осаждения эритроцитов целесообразно использовать полиглюкин при добавлении к ПК в соотношении 1:1.Использование осадка в качестве образцов для различных анализов значительно уменьшает потери ядросодержащих клеток.
Литература
- Joanne Kurtzberg Umbilical Cord Blood Bacing and Transplation. Christopher D. Hillyer et al. Blood Banking and Transfusion Medicine 2003; 593-8.
- Scott R., Burger Umbilical Cord Blood Stem Cells. Handbook of Transfusion Medicine Academic Press 2001; 171-8.
- Gluckman E., Broxmeyer H.E. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconis anemia by means of umbilical-cord blood from HLA-identical sibling. N Engl J Med 1989; 321:1174-78.
- Glucklnan E., Rocha V., Boyer-Chammard A., et. al. Outcome of cord-blood transplantation fron1 related and unrelated donors. N Engl J Med 1997; 337: 373-81.
- Kurtzberg J, Laughlin M, Graham ML, et. al. Placental blood as al source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients. N Engl J Med 1996; 335: 157-66.
- Nagarajan R., Neglia J., Ramsay N., et. al. Successful treatment of refractory Langerhans cell histiocytosis with unrelated cord blood transplantation. J Рediatr Hematol Oncol 2001; 23: 629-32.
- Gluckman E., М.D. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilical-cord blood N. Engl. J. Med 2001; 344 (24): 1860-1.
- Falkenburg J.H.F., Lim F.T.H. Использование пуповинной крови вместо костного мозга для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток . РМЖ 1996; 3 (№ 4): 24-31.
- Rocha V., Cornish J., Sievers E. L. еt. al. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia. Blood 2001; 97: 2962-71.
- Rubinstein, P., Carrier, C., Scaradavou, A., et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N Engl J Med 1998; 339(22): 1565-77.
- Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови. Вопросы онкологии 2000.; 46(№5): 513-20.
- Bertolini F., Battaglia M. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns. Blood 1995; 85: 3361-2.
- Denning-Kendall, P., Donaldson, C., Nicol, A., et al. Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking. Exp Hematol 1996; 24(12): 1394-401.
- Rubinstein, P., Dobrila, L., Rosenfield, R. E., et. al. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Froc Nat Acad Sci USA 1995; 92(22): 10119-22.
- Broxmeyer, H.E., Douglas, G.W., Hangonc., Cooper, S., Bard, J., English, D., Arny, M., Thomas, L. & Boyse, E.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86: 3828-32.
- Ballen K., Greiner D., Shulz L. et al. Blood 1997; 90(№10): 311b (4151).
- Kogler G, Somville T, Gobel U, et. al. Haematopoietic transplant potential of related cord blood: the first six yars of the EURICORD/NETCORD Bank Germany. Klin Padiatr 1999; 211: 224-32.
- Pettengell R., Luft T., Henschler R. et. al. Blood 1994; 84: 3652-9.
|
